Хроматографические методы и их использование в идентификации загрязнителей природных сред. Просто о сложном: что такое масс-спектрометрия, или как взвесить молекулу

Данный метод принципиально отличается от рассмотренных выше спектроскопических методов. Структурная масс-спектрометрия основана на разрушении органической молекулы в результате ионизации тем или иным способом.

Образующиеся ионы сортируются по величинам их отношения масса/заряд (m/z), затем регистрируется число ионов для каждого значения этого отношения в виде спектра. На рис. 5.1. представлена общая схема типичного масс-спектрометра.

Рис. 5.1. Блок-схема типичного масс-спектрометра

Для ведения пробы в масс-спектрометр обычно применяют какой-либо вид хроматографии, хотя во многих приборах есть возможность для прямого ввода образца в ионизационную камеру. Во всех масс-спектрометрах имеются устройства для ионизации пробы и разделения ионов по величине m/z. После разделения нужно детектировать ионы и измерять их количество. Типичный коллектор ионов состоит из коллимирующих щелей, которые направляют в коллектор в данный момент только ионы одного вида, где они детектируются, а сигнал детектирования усиливается электронным умножителем. Современные масс-спектрометры укомплектованы специализированным программным обеспечением: компьютеры контролируют накопление, хранение и визуализацию данных.

В настоящее время стала обычной практика объединения масс-спектрометра с газовым (ГХ-МС) или жидкостным (ЖХ-МС) хроматографом.

Все масс-спектрометры подразделяются на два класса: приборы низкого (единичного) и высокого разрешения (R). Спектрометры низкого разрешения – приборы, на которых можно разделить целые массы до m/z 3000 (R = 3000/(3000-2990) = 3000). На таком приборе соединения C 16 H 26 O 2 и С 15 Н 24 NO 2 неразличимы, поскольку прибор будет фиксировать и в первом и во втором случае массу 250.

Приборы высокого разрешения (R = 20000) смогут различить соединения C 16 H 26 O 2 (250.1933) и С 15 Н 24 NO 2 (250.1807), в этом случае R = 250.1933/(250.1933 – 250.1807) = 19857.

Таким образом, на приборах низкого разрешения можно устанавливать структурную формулу вещества, однако зачастую для этой цели дополнительно необходимо привлекать данные других методов анализа (ИК-, ЯМР-спектроскопия).

Приборы высокого разрешения могут измерять массу иона с точностью, достаточной для определения атомного состава, т.е. определять молекулярную формулу исследуемого вещества.

В последнее десятилетие происходило быстрое развитие и совершенствование масс-спектрометров. Не обсуждая их устройство, отметим, что они подразделяются по типам в зависимости от 1) способа ионизации, 2) метода разделения ионов. В общем, способ ионизации не зависит от метода разделения ионов и наоборот, хотя имеются исключения. Более полная информация по данным вопросам изложена в литературе [Сайнсб. Лебедев].

В данном пособии будут рассмотрены масс-спектры, полученные ионизацией электронным ударом.

5.2. Масс-спектры с ионизацией электронным ударом

Электронный удар (ЭУ, electron impact, EI) – наиболее распространенный метод ионизации в масс-спектрометрии. Преимуществом этого метода является возможность использования поисковых систем и баз данных (метод ЭУ был исторически первым методом ионизации, основные базы экспериментальных данных получены на приборах с ЭУ).

Молекула вещества пробы в газовой фазе подвергается бомбардировке электронов с высокой энергией (обычно 70 эВ) и выбрасывает электрон, образуя катион-радикал, называемый молекулярным ионом :

М + e → М + (молекулярный ион) + 2e

Наименьшая энергия бомбардирующих (ионизующих) электронов, при которой возможно образование из данной молекулы иона, называется энергией (или, менее удачно, «потенциалом») ионизации вещества (U e).

Энергия ионизации является мерой прочности, с какой молекула удерживает наименее сильно связанный с ней электрон.

Как правило, для органических молекул энергия ионизации составляет 9-12 эВ, поэтому бомбардировка электронами с энергией 50 эВ и выше сообщает избыточную внутреннюю энергию возникающему молекулярному иону. Эта энергия частично рассеивается за счет разрыва ковалентных связей.

В результате такого разрыва происходит распад молекулярного иона на частицы меньшей массы (фрагменты). Такой процесс называется фрагментацией .

Фрагментация происходит избирательно, является высоковоспроизводимой и характеристичной для данного соединения . Более того, процессы фрагментации предсказуемы, и именно они обуславливают широкие возможности масс-спектрометрии для структурного анализа. По-сути, структурный анализ методом масс-спектрометрии заключается в идентификации осколочных ионов и ретроспективном восстановлении структуры исходной молекулы, исходя из направлений фрагментации молекулярного иона. Так, например, метанол образует молекулярный ион по схеме:

О
дна точка – оставшийся нечетный электрон; когда заряд локализован на отдельном атоме, знак заряда указывается на этом атоме.

Многие из этих молекулярных ионов распадаются за время 10 -10 – 10 -3 с и дают ряд осколочных ионов (первичная фрагментация):

Если некоторые из молекулярных ионов имеют достаточно большое время жизни, то они достигают детектора и регистрируются в виде пика молекулярного иона. Поскольку заряд исходного иона равен единице, отношение m / z для этого пика дает молекулярную массу исследуемого вещества.

Таким образом, масс-спектр – это представление относительных концентраций положительно заряженных осколков (включая молекулярный ион) в зависимости от их масс .

В специальной литературе приводятся таблицы наиболее часто встречающихся фрагментных ионов, где указана структурная формула иона и его значение m/z [Преч, Гордон, Сильверстейн].

Высота наиболее интенсивного в спектре пика принимается за 100%, а интенсивности других пиков, включая пик молекулярного иона, выражаются в процентах от максимального пика.

В определенных случаях самым интенсивным может быть и пик молекулярного иона. В общем случае: интенсивность пика зависит от устойчивости образующегося иона .

В масс-спектрах часто присутствует серия пиков фрагментных ионов, различающихся на гомологическую разность (СН 2), т.е. 14 а.е.м. Гомологические серии ионов характерны для каждого класса органических веществ, а потому они несут важную информацию о структуре исследуемого вещества.

Введение
Краткая история масс-спектрометрии
Ионизация
Масс-анализаторы
Детектор
Природная и искусственная изотопия
Масс-спектрометры для изотопного анализа
Скорость сканирования
Разрешение
Динамический диапазон
Чувствительность
Какие бывают масс-спектрометры

Итак, масс-спектрометры используются для анализа органических соединений и неорганических.

Органические вещества в большинстве случаев представляют собой многокомпонентные смеси индивидуальных компонентов. Например, показано, что запах жареной курицы составляют 400 компонентов (то есть, 400 индивидуальных органических соединений). Задача аналитики состоит в том, чтобы определить сколько компонентов составляют органическое вещество, узнать какие это компоненты (идентифицировать их) и узнать сколько каждого соединения содержится в смеси. Для этого идеальным является сочетание хроматографии с масс-спектрометрией. Газовая хроматография как нельзя лучше подходит для сочетания с ионным источником масс-спектрометра с ионизацией электронным ударом или химической ионизацией, поскольку в колонке хроматографа соединения уже находятся в газовой фазе. Приборы, в которых масс-спектрометрический детектор скомбинирован с газовым хроматографом, называются хромато-масс-спектрометрами.

Многие органические соединения невозможно разделить на компоненты с помощью газовой хроматографии, но можно с помощью жидкостной хроматографии. Для сочетания жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией сегодня используют источники ионизации в электроспрее (ESI) и химической ионизации при атмосферном давлении (APCI), а комбинацию жидкостных хроматографов с масс-спектрометрами называют ЖХ/МС или LC/MS по английски. Cамые мощные системы для органического анализа, востребованные современной протеомикой, строятся на основе сверхпроводящего магнита и работают по принципу ионно-циклотронного резонанса. Они также носят название FT/MS, поскольку в них используется Фурье преобразование сигнала.

Новый класс масс-спектрометров - это гибридные приборы. Гибридными их называют потому, что они, на самом деле, включают в себя два масс-спектрометра, по крайней мере один из которых, может работать как независимый прибор. Примерами таких приборов являются масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса FINNIGAN LTQ FT, в котором линейная квадрупольная ионная ловушка FINNIGAN LTQ может работать как индивидуальный прибор, детектирующий ионы после МС или МСn с помощью двух вторично-электронных умножителей, так и готовить и пересылать ионы в циклотронную ячейку, выталкивая их в направлении, параллельном оси квадруполя. Также гибридным является LTQ QRBITRAP, который работает совершенно аналогично. Преимущества таких схем очевидны, линейная ловушка обладает самой высокой чувствительностью, работает в режиме тандемной масс-спектрометрии с n до 10, осуществляет разнообразные интеллектуальные функции сканирований, а масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса и орбитальная ловушка ионов обладают высоким разрешением и могут с высочайшей точностью измерять отношения массы к заряду ионов. Для анализа элементного состава самыми привлекательными являются масс-спектрометры с индуктивно-связанной плазмой. С помощью этого прибора определяют из каких атомов составлено вещество. Этот же метод анализа может показывать и изотопный состав. Но лучше всего измерять изотопный состав с помощью специализированных изотопных приборов, регистрирующих ионы не на одном детекторе в разное время их прихода на него, а каждый ион на своем персональном коллекторе и одновременно (так называемое параллельное детектирование).

Однако, прежде чем перейти к приборам для измерения изотопного состава, кратко остановимся на том что такое изотопы.

Природная и искусственная изотопия Атомы состоят из ядра и электронных оболочек. Свойства атомов определяются тем, сколько протонов (положительно заряженных элементнарных частиц) содержит ядро. Ядро помимо протонов содержит и нейтроны. Природа распорядилась так, что при равном количестве протонов ядро может содержать разное количество нейтронов. Атомы с одинаковым количеством протонов в ядре, но с разным количеством нейтронов отличаются по массе на одну или несколько единиц атомной массы (а.е.м.) и называются изотопами. Большинство элементов имеют определенный набор стабильных изотопов. Радиоактивные изотопы не являются стабильными и распадаются с образованием стабильных изотопов. Природная распространенность изотопов для каждого элемента известна. Некоторые элементы в природе являются моноизотопными, то есть 100 % природной распространенности приходится на один изотоп (например, Al, Sc, Y, Rh, Nb и т.д.), а другие имеют множество стабильных изотопов (S, Ca, Ge, Ru, Pd, Cd, Sn, Xe, Nd, Sa и т.д.). В технологической деятельности люди научились изменять изотопный состав элементов с целью получения каких-либо специфических свойств материалов (например, U235 имеет способность к спонтанной цепной реакции и может использоваться в качестве топлива для атомных электростанций или атомной бомбы) или использования изотопных меток (например, в медицине).

Поскольку массы изотопов отличаются, а масс-спектрометрия измеряет массу, естественно, этот метод становится самым удобным для определения изотопного состава. В то же время, информация по изотопному составу помогает идентифицировать органические соединения и позволяет дать ответы на многие вопросы начиная от определения возраста пород для геологии и кончая определением фальсификатов многих продуктов и установлением места происхождения товаров и сырья.

Масс-спектрометры для изотопного анализа. Масс-спектрометры для определения изотопного состава должны быть очень точными. Для анализа изотопного состава легких элементов (углерод, водород, кислород. сера, азот и т.д.) используется ионизация электронным ударом. В этом случае годятся все методы ввода газовой фазы, как и в органических масс-спектрометрах (DELTA Plus ADVANTAGE, FINNIGAN DELTA Plus XL и FINNIGAN МАТ253).
Для анализа изотопов более тяжелых элементов используется термоионизация (FINNIGAN TRITON TI) или ионизация в индуктивно-связанной плазме c параллельным детектированием (FINNIGAN NEPTUNE, и одноколлекторным детектированием FINNIGAN ELEMENT2).
Практически во всех типах изотопных масс-спектрометров используются магнитные масс-анализаторы.

Характеристики масс-спектрометров и масс-спектрометрических детекторов

Важнейшими техническими характеристиками масс-спектрометров являются чувствительность, динамический диапазон, разрешение, скорость.

Скорость сканирования. Масс-анализатор, как мы показывали выше, пропускает ионы с определенным соотношением массы и заряда в определенное время (кроме многоколлекторных приборов и ионно-циклотронного резонанса, орбитальной ловушки ионов). Для того, чтобы проанализировать все ионы по отношению их массы к заряду он должен сканировать, то есть параметры его поля должны за заданный промежуток времени пройти все значения, нужные для пропускания к детектору всех интересующих ионов. Эта скорость разворачивания поля называется скоростью сканирования и должна быть как можно больше (соответственно, время сканирования должно быть как можно меньше), поскольку масс-спектрометр должен успеть измерить сигнал за короткое время, например за время выхода хроматографического пика, которое может составлять несколько секунд. При этом, чем больше масс-спектров за время выхода хроматографического пика будет измерено, тем точнее будет описан хроматографический пик, тем менее вероятно будет проскочить мимо его максимального значения, а с помощью математической обработки определить является ли он индивидуальным и «доразделить» его с помощью масс-спектрометрии.
Самым медленным масс-анализатором является магнит, минимальное время его сканирования без особой потери чувствительности составляет доли секунды (MAT 95XP). Квадрупольный масс-анализатор может разворачивать спектр за десятые доли секунды (TSQ QUANTUM), а ионная ловушка еще быстрее (POLARISQ, FINNIGAN LCQ ADVANTAGE MAX, FINNIGAN LCQ DECA XP MAX), линейная ионная ловушка - еще быстрее (LTQ) и чуть медленнее масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса FINNIGAN LTQ FT.
Инновационный квадрупольный хромато-масс-спектрометр FINNIGAN TRACE DSQ и его экономичный аналог FINNIGAN FOCUS DSQ способны сканировать со скоростью около 11,000 а.е.м. в секунду. Это открывает новые возможности, например, можно практически одновременно получать полный масс-спектр соединения для его однозначной идентификации и вести селективный мониторинг ионов (SIM), на несколько порядков понижающий предел обнаружения.
Любое сканирование всех перечисленных выше масс-анализаторов является компромиссным - чем больше скорость сканирования, тем меньше времени тратиться на запись сигнала на каждое массовое число, тем хуже чувствительность. Однако, для обычного анализа скорости квадрупольного анализатора или ионной ловушки достаточно. Другой вопрос, когда речь идет о высокопроизводительном анализе сложных матриц. В этом случае было бы хорошо воспользоваться сверхбыстрой хроматографией (на тонких коротких быстро прогреваемых колонках). Для такой задачи лучше всего подойдет времяпролетный масс-спектрометр (TEMPUS). Он способен записывать масс-спектры со скоростью 40,000 в секунду!

Разрешение. Наглядно разрешение (разрешающую способность) можно определить, как возможность анализатора разделять ионы с соседними массами. Очень важно иметь возможность точно определять массу ионов, это позволяет вычислить атомную композицию иона или идентифицировать пептид путем сравнения с базой данных, сократив число кандидатов с тысяч и сотен до единиц или одного единственного. Для магнитных масс-анализаторов, для которых расстояние между пиками масс-спектра не зависит от масс ионов, разрешение представляет собой величину равную M/DM. Эта величина, как правило, определяется по 10 % высоте пика. Так например, разрешение 1000 означает, что пики с массами 100.0 а.е.м. и 100.1 а.е.м. отделяются друг от друга, то есть не накладываются вплоть до 10 % высоты.
Для анализаторов, у которых расстояние между пиками меняется в рабочем диапазоне масс (чем больше масса, тем меньше расстояние), таких как квадрупольные анализаторы, ионные ловушки, времяпролетные анализаторы, строго говоря, разрешение имеет другой смысл. Разрешение, определяемое как M/DM в данном случае, характеризует конкретную массу. Имеет смысл характеризовать эти масс-анализаторы по ширине пиков, величине, остающейся постоянной во всем диапазоне масс. Эта ширина пиков, обычно, измеряется на 50 % их высоты. Для таких приборов ширина пика на полувысоте равная 1 является неплохим показателем и означает, что такой масс-анализатор способен различить номинальные массы, отличающиеся на атомную единицу массы практически во всем его рабочем диапазоне. Номинальной массой или массовым числом называют ближайшее к точной массе иона целое число в шкале атомных единиц массы. Например, масса иона водорода Н+ равна 1.00787 а.е.м., а его массовое число равно 1. А такие масс-анализаторы, которые, в основном, измеряют номинальные массы, называют анализаторами низкого разрешения. Мы написали «в основном», потому что сегодня есть и такие масс-анализаторы, которые формально относятся к низкоразрешающим, а на деле таковыми уже не являются. Высокая технология, прежде всего самого передового разработчика Thermo Electron, уже сегодня предложила на рынок аналитического оборудования высокоразрешающие квадрупольные приборы. Так например, новейший FINNIGAN TSQQuantum легко работает при ширине пика масс-спектра на полувысоте 0.1 а.е.м. Знающие люди могут возразить: «Но такую ширину пика можно получить на каждом квадрупольном масс-спектрометре!» И они будут правы, действительно, каждый квадруполь можно отстроить до этого уровня разрешения. Но что произойдет при этом с сигналом? При переходе от ширины пика на полувысоте в 1 а.е.м. к 0.1 а.е.м. величина сигнала на всех квадруполях упадет практически на два порядка по величине. Но не на TSQ Quantum , на нем она уменьшится всего в два с половиной раза. Ионные ловушки в узком диапазоне масс могут работать как масс-спектрометры высокого разрешения, обеспечивая, как минимум, разделение пиков, отстоящих на 1/4 а.е.м. друг от друга. Масс-спектрометры с двойной фокусировкой (магнитной и электростатической), ионно-циклотронного резонанса - приборы среднего или высокого разрешения. Типичным для магнитного прибора разрешением является >60,000, а работа на уровне разрешения 10,000 - 20,000 является рутинной. На масс-спектрометре ионно-циклотронного резонанса на массе около 500 а.е.м. можно легко достигнуть разрешения 500,000, что позволяет проводить измерения массы ионов с точностью до 4-5 знака после запятой. Разрешения в несколько тысяч также можно добиваться при использовании времяпролетных масс-анализаторов, однако, на высоких массах, в области которых, собственно этот прибор имеет преимущество перед другими, и этого разрешения хватает лишь для того, чтобы измерить массу иона с точностью +/- десятки а.е.м.Как видно из вышесказанного, разрешение тесно связано с другой важной характеристикой - точностью измерения массы. Проиллюстрировать значение этой характеристики можно на простом примере. Массы молекулярных ионов азота (N2+)и монооксида углерода (СО+) составляют 28.00615 а.е.м. и 27.99491 а.е.м., соответственно (оба характеризуются одним массовым числом 28). Эти ионы будут регистрироваться масс-спектрометром порознь при разрешении 2500, а точное значение массы даст ответ - какой из газов регистрируется. Измерение точной массы доступно на приборах с двойной фокусировкой, на тандемном квадрупольном масс-спектрометре TSQ Quantum и на масс-спектрометрах ионно-циклотронного резонанса.

Динамический диапазон. Если мы анализируем смесь, содержащую 99.99 % одного соединения или какого-либо элемента и 0.01% какой-либо примеси, мы должны быть уверены, что правильно определяем и то и другое. Для того, чтобы быть уверенным в определении компонентов в этом примере, нужно иметь диапазон линейности в 4 порядка. Современные масс-спектрометры для органического анализа характеризуются динамическим диапазоном в 5-6 порядков, а масс-спектрометры для элементного анализа 9-12 порядков. Динамический диапазон в 10 порядков означает, что примесь в пробе будет видна даже тогда, когда она составляет 10 миллиграмм на 10 тонн.

Чувствительность. Это одна из важнейших характеристик масс-спектрометров. Чувствительность это величина, показывающая какое количество вещества нужно ввести в масс-спектрометр для того, чтобы его можно было детектировать. Для простоты будем рассматривать связанный с чувствительностью параметр - минимальное определяемое количество вещества, или порог обнаружения. Типичная величина порога обнаружения хорошего хромато-масс-спектрометра, используемого для анализа органических соединений, составляет 1 пикограмм при вводе 1 микролитра жидкости. Давайте представим себе что это такое. Если мы наберем специальным шприцом 1 микролитр жидкости (одна миллионная доля литра) и выпустим ее на листок чистой белой бумаги, то при ее рассмотрении в лупу мы увидим пятнышко, равное по размерам следу от укола тонкой иглой. Теперь представим себе, что мы бросили 1 грамм вещества (например, одну таблетку аспирина) в 1000 тонн воды (например, бассейн длиной 50 метров, шириной 10 метров и глубиной 2 метра). Тщательно перемешаем воду в бассейне, наберем шприцом 1 микролитр этой воды и заколем в хромато-масс-спектрометр. В результате анализа мы получим масс-спектр, который мы сможем сравнить с библиотечным спектром и методом отпечатков пальцев убедиться в том, что это действительно ацетилсалициловая кислота, иначе называемая аспирином.

Пределы обнаружения неорганических веществ, например, методом ICP/MS (FINNIGAN ELEMENT2) еще более впечатляющие. Здесь бассейн уже будет маловат для приготовления раствора с концентрацией, соответствующей пределу обнаружения. Предел обнаружения для FINNIGAN ELEMENT2 по ряду металлов составляет 1 ppq (одна доля на квадриллион). Это значит, что чувствительности прибора достаточна, чтобы детектировать 1 килограмм металла (например, ртути, свинца и т.д.) растворенного в озере Байкал (при условии его перемешивания и полного растворения)!

В масс-спектрометрии изотопов, например, достаточно 800 - 1000 молекул диоксида углерода (СО2, углекислый газ) чтобы получить сигнал углерода. Для того, чтобы продемонстрировать, с какими точностями и изотопными чувствительностями имеет дело изотопная масс-спектрометрия, прибегнем к следующей аллегории. Предположим на одну тысячу совершенно одинаковых яблок, каждое из которых весит 100 грамм, приходится 11 яблок, весящих на 8 % больше, то есть 108 грамм. Все эти яблоки собраны в одном мешке. Этот пример соотвествует соотношению изотопов углерода в природе - на 1000 атомов 12С приходится 11 атомов 13С. Изотопная масс-спектрометрия измеряет соотношения, то есть она способна различить не просто эти 11 яблок, а найти среди многих мешков те, в которых из 1000 стограммовых яблок не 11 стовосьми граммовых, а 10 или 12. Этот пример очень легок для изотопной масс-спектрометрии, на самом деле такие приборы как FINNIGAN DELTAPlus ADVANTAGE, DELTA Plus XP и FINNIGAN МАТ253способны определить разницу в один изотоп (одно сто восьмиграммовое яблоко) среди десяти миллионов атомов (десяти миллионов яблок).

Важнейшая характеристика при анализе органических соединений - это чувствительность. Для того, чтобы достигнуть как можно большей чувствительности при улучшении отношения сигнала к шуму прибегают к детектированию по отдельным выбранным ионам. Выигрыш в чувствительности и селективности при этом колоссальный, но при использовании приборов низкого разрешения приходится приносить в жертву другой важный параметр - достоверность. Ведь если Вы записывали только один пик из всего характеристического масс-спектра, Вам понадобится еще много поработать, чтобы доказать, что этот пик соответствует именно тому компоненту, который Вас интересует. Как же разрешить эту проблему? Использовать высокое разрешение на приборах с двойной фокусировкой, где можно добиться высокого уровня достоверности не жертвуя чувствительностью. Или использовать тандемную масс-спектрометрию, когда каждый пик, соответствующий одиночному иону можно подтвердить масс-спектром дочерних ионов. Итак, абсолютным рекордсменом по чувствительности является органический хромато-масс-спектрометр высокого разрешения с двойной фокусировкой. Так, например, паспортная характеристика DFS гласит, что 2,3,7,8-тетрахлоро-п-дибензодиоксин, введенный через хроматографическую колонку в количестве 10 фемтограмм даст пик, характеризующийся отношением сигнал/шум = 80: 1. Не достижимый ни на каком другом приборе результат!
По характеристике сочетания чувствительности с достоверностью определения компонентов следом за приборами высокого разрешения идут ионные ловушки. Классические квадрупольные приборы нового поколения (TRACE DSQ II) имеют улучшенные характеристики благодаря ряду инноваций, примененных в них, например, использованию искривленного квадрупольного префильтра, предотвращающего попадание нейтральных частиц на детектор и, следовательно, снижению шума.

Зачем нужна масс-спектрометрия

Глубинные физические законы, передовые научные и инженерные разработки, высокотехнологичные вакуумные системы, высокие электрические напряжения, самые лучшие материалы, высочайшее качество их обработки, современнейшая быстродействующая цифровая и аналоговая электроника и компьютерная техника, изощренное программное обеспечение - вот из чего сложен современный масс-спектрометр. И для чего же все это? Для ответа на один из важнейших вопросов мироздания - из чего сложена материя. Но это вопрос не высокой науки, а каждодневной жизни человека.

Например, разработка новых лекарственных средств для спасения человека от ранее неизлечимых болезней и контроль производства лекарств, генная инженерия и биохимия, протеомика. Масс-спектрометрия дала в руки исследователей инструмент, позволяющий идентифицировать белки, определять какие изменения произошли с их структурой вследствие различных взаимодействий, при их воспроизводстве, определить пути метаболизма различных лекарственных средств и других соединений и идентифицировать метаболиты, разрабатывать новые целевые лекарственные средства. Масс-спектрометрия - единственный метод, решающий все эти и многие другие задачи аналитической биохимии.
Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ.

Выяснение источника происхождения очень важно для решения целого ряда вопросов: например, определение происхождения взрывчатых веществ помогает найти террористов, наркотиков - бороться с их распространением и перекрывать пути их трафика. Экономическая безопасность страны более надежна, если таможенные службы могут не только подтверждать анализами в сомнительных случаях страну происхождения товара, но и его соотвествие заявленному виду и качеству. А анализ нефти и нефтепродуктов нужен не только для оптимизации процессов переработки нефти или геологам для поиска новых нефтяных полей, но и для того, чтобы определить виновных в разливах нефтяных пятен в океане или на земле.

В эпоху «химизации сельского хозяйства» весьма важным стал вопрос о присутствии следовых количеств применяемых химических средств (например, пестицидов) в пищевых продуктах. В мизерных количествах эти вещества могут нанести непоправимый вред здоровью человека.

Целый ряд техногенных (то есть не существующих в природе, а появившихся в результате индустриальной деятельности человека) веществ являются супертоксикантами (имеющими отравляющее, канцерогенное или вредное для здоровья человека действие в предельно низких концентрациях). Примером является хорошо известный диоксин.

Существование ядерной энергетики немыслимо без масс-спектрометрии. С ее помощью определяется степень обогащения расщепляющихся материалов и их чистота.

Конечно и медицина не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия углеродных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфицированности человека Helicobacter Pylori и является самым надежным из всех методов диагностики.
ВЭЖХ/МС системы являются основным аналитическим инструментом при разработке новых лекарственных средств. Без этого метода не может обходиться и контроль качества производимых лекарств и выявления такого распространенного явления как их фальсификация.
Протеомика дала в руки медицины возможность сверхранней диагностики самых страшных заболеваний человечества - раковых опухолей и кардиологических дисфункций. Определение специфических белков, называемых биомаркерами, позволяет проводить раннюю диагностику в онкологии и кардиологии.

Трудно представить область человеческой деятельности, где не нашлось бы места масс-спектрометрии. Ограничимся просто перечислением: биохимия, клиническая химия, общая химия и органическая химия, фармацевтика, косметика, парфюмерия, пищевая промышленность, химический синтез, нефтехимия и нефтепереработка, контроль окружающей среды, производство полимеров и пластиков, медицина и токсикология, криминалистика, допинговый контроль, контроль наркотических средств, контроль алкогольных напитков, геохимия, геология, гидрология, петрография, минералогия, геохронология, археология, ядерная промышленность и энергетика, полупроводниковая промышленность, металлургия.

ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Химический факультет

Курсовая работа на тему
«Масс-спектрометрический метод анализа»

Выполнил: студент группы Х-202
Меньшенин А.Н.

Проверила: Данилина Е.И.

Линейная ионная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вдоль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиочастотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основное преимущество линейной ловушки перед 3D – больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и улучшает диапазон количественного анализа.
Ограничения ионной ловушки: сканирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамический диапазон.

Главными ограничениями данных возможностей ионной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным средством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способность давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупольного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средним затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношения между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента составляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюстрацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не будут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничения на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушки пространственные влияние зарядов ограничит представительность анализатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число вошедших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопровождается большим фоном других ионов.

Двуфокусирующий магнитный сектор

Первые анализаторы масс разделяли ионы при помощи магнитного поля. В магнитом анализе ионы ускоряются в магнитном поле при помощи электрического. Заряженные частицы, движущиеся в магнитно поле, будут двигаться по дуге, радиус которой зависит от скорости ион, силы магнитного поля и m / z иона. Масс-спектр получается сканированием магнитного поля и наблюдением того, как ионы попадают фиксированный точечный детектор. Ограничением магнитных анализаторов является относительно малое разрешение. Чтобы улучшить его, магнитные приборы были модифицированы с добавлением электростатического анализатора, чтобы сфокусировать ионы. Такие приборы называются двухсекторными. Электрический сектор служит как элемент фокусировки кинетической энергии, позволяя только ионам с определённой кинетической энергией проходить через поле, независимо от их m / z отношения. То есть, добавление электрического сектора позволяет только ионам с одинаковой энергией достигать детектора, тем самым уменьшая разброс кинетической энергии, что, в свою очередь, увеличивает разрешение. Нужно отметить, что увеличение разрешения вызывает соответствующее уменьшение чувствительности. Такие двуфокусирующие (рис. 2.7) анализаторы масс используются совместно с ESI, FAB и EI, однако они нешироко используются сейчас, в основном, из-за их больших размеров и успешности времяпролётных, квадрупольных и FTMS анализаторов с ESI и

MALDI.

Квадрупольная-времяпролётная тандемная масс-спектрометрия

Линейный времяпролётный (TOF) анализатор масс (рис. 2.7 ) является простейшим анализатором масс. Он пережил возрождение с изобретением MALDI и его текущее применения для электроспрея и даже газовой хроматографии с масс-спектрометрией электронной ионизацией (GC/MS). Времяпролётный анализ основан на ускорении группы ионов по направлению к детектору, при котором всем ионам сообщается одинаковая энергия при помощи ускоряющего потенциала. Так как ионы имеют одинаковую энергию, но разную массу, лёгкие ионы достигают детектора первыми из-за их большей скорости, в то время как тяжёлые ионы летят дольше из-за их большей массы и, соответственно, более низкой скорости. Поэтому анализатор был назван времяпролётным, потому что масса в нём определяется по времени прибытия ионов. Масса, заряд и кинетическая энергия – всё это вносит свой в клад в время прибытия иона к детектору. Так как кинетическая энергия (KE) иона равна ½ mv 2 , скорость иона может быть представлена как v = d/t = (2KE/m) ½ . Ионы проходят расстояние d за время t, а t зависит от m / z . В этом уравнении v = d/t = (2KE/m) ½ , принимая z = 1. Другим представлением этого уравнения, более чётко показывающим, как определяется масса, является m=2t 2 KE/d 2 , где KE=const .

Времяпролётный рефлектрон (рис. 2.8 ) сейчас широко используется для ESI, MALDI, а в последнее время и для приложения электронной ионизации для ГХ/МС. Он комбинирует времяпролётную технологию и электростатическое зеркало. Рефлектрон служит для увеличения времени (t), которое нужно ионам, чтобы достичь детектора, при этом уменьшая распределение кинетической энергии, тем самым уменьшая временное распределение Δt. Так как разрешение определяется как масса пика, делённая на его ширину или m/Δm (или t/Δt, так как m пропорциональна t), увеличение t и уменьшение Δt приводит к росту разрешения. Поэтому TOF рефлектрон даёт более высокое разрешение по сравнению с простым прибором TOF посредством увеличения длины пути и фокусировки энергии посредством рефлектрона. Нужно отметить, что увеличенное разрешение (обычно выше 5000) и чувствительность на TOF рефлектроне значительно уменьшается при высоких массах (обычно при m / z свыше 5000).

Другим типом тандемного анализа масс, MS/MS, является также возможное комбинирование MALDI и TOF рефлектрона. MS/MS осуществляется с особенности MALDI – фрагментации, которая происходит после ионизации, или распадом после источника (PSD). Времяпролётные приборы сами по себе не разделяют пост-ионизационные фрагментарные ионы от одного и того же иона-прекурсора, потому что и прекурсор, и фрагментарные ионы имеют одинаковую скорость и поэтому достигают детектора в одно и то же время. Рефлектрон даёт преимущество в том, что фрагментарные ионы имеют разную кинетические энергии и разделяются на основании того, как глубоко ионы проникают в поле рефлектрона, тем самым давая спектр фрагментарных ионов (рис. 2.9 и 2.10 ).

Нужно заметить, что электроспрей также был адаптирован под TOF рефлектронные анализаторы, в которых ионы из непрерывного ESI-источника накапливаются в гексаполярном (или октаполярном) ионопроводе, а затем выталкиваются в TOF анализатор. Тем самым, необходимая электростатическая импульсность создаёт точку отсчёта, с которой можно начинать измерения TOF.

MALDI и времяпролётный анализ

На начальных этапах развития MALDI-TOF, эти приборы имели относительно низкое разрешение, которое серьёзно ограничивало их точность. Нововведением, которое оказало существенный эффект на увеличение разрешающей силы MALDI времяпролётных приборов было отложенное извлечение (DE), как показано на рис. 2.11 . В теории, отложенное извлечение означает просто охлаждение и фокусировку ионов сразу после акта MALDI, но на практике сначала было проблемой включать и выключать импульсы в 10000 вольт за наносекунды.

В традиционных приборах MALDI, ионы ускоряются из устройства ионизации сразу после образования. Однако, отложенное извлечение ионов позволяет им «остыть» в течение ~150 наносекунд перед ускорением в анализатор. Этот период охлаждения генерирует набор ионов с гораздо меньшим распределением кинетической энергии, значительно уменьшая временной разброс ионов, когда они входят в TOF анализатор. В общем, это приводит к увеличению разрешения и точности. Выгоды отложенного извлечения значительно сокращаются для больших макромолекул, таких как белки (>30000 Да).

Квадрупольная времяпролётная масс-спектрометрия

Квадрупольные времяпролётные анализаторы масс обычно совмещаются с устройствами ионизации электроспрея, а в последнее время успешно совмещаются с MALDI. ESIquad-TOF (рис. 2.12 ) комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой эффективностью, чувствительностью и точностью времяпролётного рефлектронного анализатора масс. Квадруполь может выступать как простой квадрупольный анализатор, чтобы сканировать определённый диапазон m / z . Однако он может быть также использован, чтобы селективно выделить ион-прекурсор и направить его в ячейку столкновения. Получившиеся фрагментарные ионы затем анализируются TOF рефлектронным анализатором масс. Квадрупольный TOF использует способность квадруполя выделять отдельный ион и способность TOF-MS совершать одновременное и точное измерение ионов по всему диапазону масс за короткий период времени. Квадрупольные TOF анализаторы выдают большую чувствительность и точность, нежели тандемные квадрупольные приборы при получении полных фрагментарных масс-спектров.

Квадрупольный TOF прибор может использовать квадрупольный или TOF анализаторы независимо или совместно для тандемных MSэкспериментов. TOF компонент прибора имеет больший m / z предел, превышающий 10000. Высокая разрешающая сила (~10000) TOF также обеспечивает хорошую точность измерения массы – порядка 10 ppm. Из-за своей высокой точности и чувствительности, ESIquad-TOF масс-спектрометр внедряются в решение проблем протеомики и фармакокинетики.

Масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (FTMS)

FTMS основана на принципе наблюдения за орбитальным движением заряженных частиц в магнитном поле (рис. 2.13-14 ). Пока ионы движутся по орбитам, импульсный радиочастотный (RF) сигнал используется для их возбуждения. Это RF возбуждение позволяет ионам продуцировать заметный экранирующий ток, вводя их в когерентное движение и увеличивая радиус орбиты. Экранирующий ток, генерируемый всеми ионами, может быть затем Фурье-преобразован, чтобы получить составляющие частоты различных ионов, которые соотносятся с их m / z . Так как частоты могут быть определены с высокой точностью, соответствующие им m / z также могут быть вычислены с высокой точностью. Важно отметить, что сигнал генерируется только когерентным движением ионов в условиях ультравысокого вакуума (10 -11 -10 -9 Торр). Этот сигнал должен быть измерен за минимальное время (обычно от 500 мс до 1 секунды), чтобы обеспечить высокое разрешение. По мере увеличения давления, сигнал затухает быстрее, вследствие потери когерентности движения из-за столкновений (например, меньше чем за 150 мс) и не позволяет провести измерения с высоким разрешением (рис. 2.14 ).

Ионы, находящиеся в когерентном циклотронном движении между двумя электродами изображено на рис. 2.13 . По мере того, как положительно заряженные ионы двигаются от верхнего электрона и приближаются к нижнему, электрическое поле ионов вынуждает электроны внешней цепи течь и накапливаться на нижнем электроде. На другой половине циклотронной орбиты электроны покидают нижний электрод и накапливаются на верхнем электроде, когда ионы приближаются. Колебательное движение электронов внешней цепи называется экранирующим током. Когда смесь ионов с различными значениями m / z одновременно ускоряется, сигнал экранирующего тока на выходе усилителя представляет собой составной установившийся сигнал с составляющими частотам, соответствующими каждому значению m / z . Проще говоря, все ионы, запертые в ячейке анализатора, возбуждаются до высоких циклотронных орбит при помощи радиочастотного импульса. Составной установившийся сигнал экранирующего тока ионов по мере их релаксации обрабатывается компьютером, и используется преобразование Фурье для выделения индивидуальных циклотронных частот. Влияние давления на сигнал и разрешение продемонстрировано на рис. 2.14.

Вдобавок к высокому разрешению, FTMS также обладает способностью обеспечивать эксперименты с многократными столкновениями (MS n). FTMS способна к исключению всех ионов, кроме нужного. Выделенный ион затем подвергается столкновению с газом (или другой форме возбуждения: лазерному облучению или электронному захвату) для вызывания фрагментации. Анализ масс может быть затем проведён для фрагментов, чтобы получить спектр фрагментации. Высокое разрешение FTMS/MS также даёт точные измерения масс фрагментов.

FTMS является довольно новым методом для биомолекулярного анализа, но множество её преимуществ делают её всё более и более интересной. Сейчас становится всё более обычным объединение ультравысокого разрешения (>10 5) FTMS с большим разнообразием способов ионизации, включая MALDI, ESI, APCI и EI. Результатом высокой разрешающей способности FTMS анализатора является высокая точность (часто порядка долей ppm) как показано для белка на рис. 2.16 , где можно видеть отдельные пики изотопов. Фурье преобразование сигнала ICR значительно увеличивает удобство ICR за счёт одновременного измерения перекрывающихся частот, произведённых внутри ячейки ICR. Индивидуальные частоты могут быть затем легко и точно переведены в m / z ионов.

В общем, увеличение магнитного поля (B) оказывает благоприятный эффект на характеристики. Фурье преобразование IRC сигнала, измеряя перекрывающиеся частоты одновременно, позволяет достичь высокого разрешения и большой точности определения масс без соответствующего уменьшения чувствительности. Это – чёткое отличие от двухсекторными приборами, которые подвержены потерям чувствительности при высочайших разрешении и точности. Высокие возможности разрешения FTMS прямо связаны с полем FTMS сверхпроводящего магнита, так как увеличение разрешения прямо пропорционально полю. Ионная вместимость, так же как MS/MS эксперименты по кинетической скорости увеличиваются пропорционально квадрату величины поля, тем самым увеличивая динамический диапазон и фрагментарную информацию. Одним из препятствий в увеличении B является эффект магнитного зеркала, когда перенос ионов внутрь магнитного поля становится всё более трудным из-за магнитных силовых линий. Также, изготовление высокопольных магнитов с большими отверстиями превосходной гомогенностью поля (для IRC) становится технически всё более сложным.

Магнитное поле влияет на FTMS оборудование следующими путями :

Так как частота иона = K*B*z/m, большее магнитное поле обеспечивает большую частоту для того же m / z , поэтому генерируется больше опорных точек для более точного определения частоты, что ещё больше увеличивает точность (рис. 2.17 ).

Квадрупольная FTMS и квадрупольной ионной ловушки FTMS анализаторы масс, которые в последнее время стали использоваться, обычно объединяются с ESI устройствами. Квадрупольная FTMS комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой точностью FTMS. Квадруполь может действовать как любой простой квадрупольный анализатор для сканирования по диапазону m / z . Однако он также может быть использован для селективного избирания иона-прекурсора и направления этого иона в ячейку столкновений или на FTMS. Полученные прекурсор и фрагментарные ионы могут быть затем анализированы при помощи FTMS.

Проведение MS/MS экспериментов вне магнитного поля предоставляет некоторые преимущества, так как высокое разрешение в FTMS зависит от высокого вакуума. MS/MS эксперименты включают в себя столкновения при установившемся высоком давлении (10 -6 – 10 -7 Торр), которое затем необходимо уменьшить, чтобы добиться высокого разрешения (10 -10 – 10 -9 Торр). Проведение MS/MS экспериментов вне ячейки, тем самым, оказывается быстрее, так как в IRC ячейке может поддерживаться ультравысокий вакуум. Это делает более новую гибридную компоновку прибора оптимальной по сравнению с комбинацией FTMS/MS с методами разделения, такими как ЖХ.

Таблица 2.2. Общее сравнение анализаторов масс, обычно используемых совместно с ESI. Эти значения могут меняться в зависимости от производителя прибора.

Квадрупольный	Ионная ловушка	Времяпролётный	Времяпролётный рефлектрон	Магнитный сектор	FTMS	Квадрупольный TOF
Точность	0.01% (100 ppm)	0.01% (100 ppm)	0.02 to 0.2% (200 ppm)	0.001% (10 ppm)	<0.0005% (<5 ppm)	<0.0005% (<5 ppm)	0.001% (10 ppm)
Разрешение	4,000	4,000	8,000	15,000	30,000	100,000	10,000
Диапазон m/z	4,000	4,000	>300,000	10,000	10,000	10,000	10,000
Скорость сканирования	~ секунда	~ секунда	миллисекунды	миллисекунды	~ секунда	~ секунда	~ секунда
Тандемная MS	MS 2 (тройной квадруполь)	MS n	MS	MS 2	MS 2	MS n	MS 2

Хромато-масс-спектрометрия — аналитический метод, основанный на сочетании возможностей хроматографа и масс-спектрометра, использующийся для количественного и качественного определения отдельных компонентов в сложных смесях. В этой статье будут рассмотрены основные вопросы, касающиеся сути хромато-масс-спектрометрии и ее особенностей:

Прибор, с помощью которого проводится исследование, получил название хромато-масс-спектрометра или ХМС. Проходя через хроматограф, проба разделяется на компоненты, а масс-спектрометр отвечает за их идентификацию и анализ. В зависимости от особенностей исследуемого состава и требований к точности результата, используется одна из двух методик: или высокоточная жидкостная хроматография, или газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием ГХ-МС.

Исследуемый состав вводится в испаритель хроматографа и моментально переводится в газообразную форму, смешивается с инертным газом-носителем и под давлением подается в колонку. Проходя через хроматографическую колонку, проба разделяется на компоненты, которые подаются в МС и пропускаются через спектрометрическую составляющую устройства.

Для получения спектра, молекулы компонентов пробы ионизируются, специальный датчик считывает изменение ионного тока, на основании чего записывается хроматограмма. Программное обеспечение для обработки хроматограмм позволяет сверить полученные пики с зарегистрированными ранее, и тем самым, проводя их точное качественное и количественное определение. Одновременно с этим делается снимок масс-спектра, дающий представление о строении компонентов, в том числе и не идентифицированных ранее.

Хромато-масс-спектрометрия была разработана в 50-х годах прошлого века, а первый прибор собран и протестирован в 60-х годах.

Эффективность и результативность хромато-масс-спектрометрии задается чувствительностью ХМС, которые постоянно совершенствуются, что позволяет расширять применение системы ГХ-МС.

Высокую точность показывает селективное детектирование. Его суть сводится к записи показаний не по всему объему поступающего ионного тока, а по максимальным для предполагаемых молекул ионам. Это удешевляет метод и позволяет обнаруживать минимальное содержание заданного вещества в любых составах. Поэтому хромато-масс-спектрометрия активно применяется в медицине и фармакологии для поиска конкретных маркеров: например, гормонов или наркотиков в биологических жидкостях.

Высокой чувствительностью обладает хромато-масс-спектрометр с МСД ISQ. Особенности применяемого в нем детектора заключаются в:

использовании специальных материалов, обеспечивающих высокий ионный выход в любых рабочих режимах;
системе автоматической обработки сигнала посредством возможностей ПО;
системе автоматической настройки МС;
системе автоматической диагностики МС;
сочетании высококачественных электродов с цифровой системой детектирования, позволяющим повысить скорость сканирования;
специальной системе подавления шумов от остаточного гелия.

Высокая чувствительность и широкая сфера применения хроматомасс-спектрометра, вполне оправдывает его цену.

На качество результата влияет еще и скорость записи масс-спектра, которая должна быть значительно выше, чем построение хроматографического пика. Если скорость снижается, появляются пиковые наложения и искажения результата анализа.

Этот параметр зависит от установленного масс-анализатора. Оптимальной в настоящее время является квадрупольная система, функционирующая по следующему принципу. Поток проходит через четыре магнита, создающих высокочастотное поле. Попадая в него, частицы с определенным отношением массы и заряда попадают в уловитель, все остальные «отсеиваются».

МС через равные промежутки времени сканирует спектры анализируемых веществ. Затем каждый статистический снимок обрабатывается, и суммарная величина дает представление о совокупности спектров в каждый момент времени. На большинстве современных МС (например, на агрегатах с МСД ISQ, о которых рассказывалось выше), установлен именно этот тип анализаторов.

Оборудование для масс-хроматографии отличается своими параметрами и возможностями. Чтобы подобрать технику, отвечающую потребностям современного пользователя, необходимо учитывать следующие параметры:

используемый источник ионизации (электронный удар, химическая ионизация);
чувствительность наиболее распространенных МС позволяют достичь 10-9…10-12 г на разных режимах сканирования;
возможность сканирования: желательно, чтобы хромато-масс-спектрометр поддерживал селективный поиск по указанным группам частиц (режим SIM) , а также выполнял полное сканирование в заданном диапазоне (режим Full scan).

Большое значение для хромато-масс-спектрометрии приобретает программное обеспечение, поставляющееся в комплекте. Оно определяет возможность построения хроматограммы в режиме реального времени, контроль над стабильностью заданных параметров, автоматическое получение отчетности в удобной для специалиста форме. От ПО зависит, насколько удобен в работе хромато-масс-спектрометр. Дополнительно разработчики предлагают набор библиотек, в которых содержатся спектры для различных промышленных и научных сфер: медицины и фармакологии (гормоны, наркотики, лекарственные препараты), нефтедобывающей отрасли (углеводороды), экологии (пестициды и другие органические загрязнители) и др.

Подбирая хромато-масс-спектрометр, необходимо учитывать все спецификации. Тогда приобретенное устройство будет полностью отвечать потребностям пользователя.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ( , масс-спектральный анализ), метод анализа в-ва путем определения массы (чаще, отношения массы к заряду m/z) и относит. кол-ва , получаемых при ионизации исследуемого в-ва или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относит. величин токов этих , представленная в виде графика или таблицы, наз. масс-спектром в-ва (рис. 1).

Начало развитию масс-спектрометрии положено опытами Дж. Томсона (1910), исследовавшего пучки заряженных частиц, разделение к-рых по массам производилось с помощью электрич. и магн. полей, а спектр регистрировался на . Первый построен А. Демпстером в 1918, а первый масс-спектрограф создал Ф. Астон в 1919; он же исследовал изотопич. состав большого числа элементов. Первый серийный создан А. Ниром в 1940; его работы положили начало изотопной масс-спектрометрии. Прямое соединение с газо-жидкостным (1959) дало возможность анализировать сложные смеси летучих соед., а соединение с жидкостным с помощью термораспылит. устройства (1983) -смеси труднолетучих соединений.
Macс-спектральные приборы. Для разделения исследуемого в-ва по величинам m/z, измерения этих величин и токов разделенных используют масс-спектральные приборы. Приборы, в к-рых регистрация осуществляется электрич. методами, наз. , а приборы с регистрацией на - масс-спектрографами. Масс-спектральные приборы состоят из системы ввода (система напуска), ионного источника, разделительного устройства (масс-анализатора), детектора (приемника ), обеспечивающих достаточно глубокий во всей вакуумной системе прибора, и системы управления и обработки данных (рис. 2). Иногда приборы соединяют с ЭВМ.

Масс-спектральные приборы характеризуются чувствительностью, к-рая определяется как отношение числа зарегистрированных к числу введенной . За абс. порог чувствительности принимают миним. кол-во исследуемого в-ва (выраженное в г, ), за относительный - миним. массовую или объемную долю в-ва (выраженную в %), к-рые обеспечивают регистрацию выходного сигнала при отношении сигнал-шум 1:1.
Ионный источник предназначен для образования газообразных исследуемого в-ва и формирования ионного пучка, к-рый направляется далее в масс-анализатор. наиб. универсальный метод ионизации в-ва - электронный удар. Впервые осуществлен П. Ленардом (1902). Совр. источники такого типа построены по принципу источника А. Нира (рис. 3).

Рис. 3. Схема ионного источника типа источника А. Нира: 1 - постоянный магнит; 2 - ; 3 - выталкивающий ; 4 - поток ; 5 - ловушка ; 6 - ионный луч; 7 - ввод в-ва.

Под действием поля, силовые линии к-рых направлены перпендикулярно направлению движения ионного пучка, двигаются по круговой траектории с радиусом r = (2Vm n /zH 2) 1/2 , где V - напряжение, ускоряющее , m n - масса , z - заряд , H - напряженность магн. поля. с одинаковой кинетич.
энергией, но с разными массами или зарядами проходят через анализатор по разл. траекториям. Обычно развертка масс-спектра (регистрация с определенными значениями m/z) осуществляется изменением Н при постоянном V. Разброс , вылетающих из ионного источника, по кинетич. энергиям, а также несовершенство фокусировки по направлениям приводят к уширению ионного пучка, что сказывается на разрешающей способности. Для статич. масс-анализатора R = r/(S 1 + S 2 + d ), где S 1 и S 2 - соотв. ширина входной и выходной щелей, d - уширение пучка в плоскости выходной щели. Уменьшение размера щелей для увеличения разрешающей способности прибора трудно осуществимо технически и, кроме того, приводит к очень малым ионным токам, поэтому обычно конструируют приборы с большим радиусом траектории (r = 200 - 300 мм). Разрешающая способность м. б. повышена также при использовании масс-анализаторов с двойной фокусировкой. В таких приборах ионный пучок пропускают сначала через отклоняющее электрич. поле спец. формы, в к-ром осуществляется фокусирование пучка по энергиям, а затем через магн. поле, в к-ром фокусируются по направлениям (рис. 5).

Рис. 5. Схема масс-анализатора с двойной фокусировкой: S 1 и S 2 - щели источника и детектора ; 1 - конденсатор; 2 - магнит.

Существует более 10 типов динамич. масс-анализаторов: квадруполъный, время-пролетный, циклотронно-резонансный, магнитно-резонансный, радиочастотный, фарвитрон, омегатрон и др. Ниже рассмотрены наиб. широко применяемые масс-анализаторы. Квадрупольный масс-анализатор представляет собой квадруполъный конденсатор (рис. 6), к параллельных стержней к-рого приложены постоянное напряжение V и переменное высокочастотное V 0 cos w t (w - частота, t - время); их суммы для каждой равны по величине и противоположны по знаку.

Рис. 6. Схема квадрупольного масс-анализатора: 1 - высокочастотный генератор; 2 - генератор постоянного напряжения; 3 - генератор развертки; 4 и 5 -источник и детектор .

Вылетевшие из ионного источника, движутся в камере анализатора вдоль оси z, параллельной продольным осям стержней, по сложным объемным спиралевидным траекториям, совершая поперечные колебания вдоль осей x и у. При фиксированных значениях частоты и амплитуды переменного напряжения с определенными значениями m/z проходят через квадруполъный конденсатор, у с др. значениями m/z амплитуда поперечных колебаний достигает такой величины, что они ударяются о стержни и разряжаются на них. Развертка масс-спектра производится путем изменения постоянного и переменного напряжении или частоты. Для совр. квадрупольных R = 8000. Первый квадрупольный прибор построен В. Паули и X. Штайнведелем (ФРГ, 1953). Время-пролетный масс-анализатор представляет собой эквипотенциальное пространство, в котором дрейфуют , разделяясь по скоростям движения (рис. 7). , образующиеся в ионном источнике, очень коротким электрич. импульсом "впрыскиваются" в виде "ионного пакета" через сетку в анализатор. В процессе движения исходный ионный пакет расслаивается на пакеты, состоящие из с одинаковыми значениями m/z. Скорость дрейфа отслоившихся ионных пакетов и, следовательно, время их пролета через анализатор длиной L вычисляется по ф-ле: (V - напряжение). Совокупность таких пакетов, поступающих в детектор, образует масс-спектр. Для совр. приборов R = 5000 - 10000. Первый прибор создан А. Камероном и Д. Эгтерсом (США, 1948), а в СССР - Н. И. Ионовым (1956).

Рис. 7. Схемавремя-пролетного масс-анализатора: 1 - сетка; 2 - детектор.

В 1973 Б. А. Мамыриным сконструирован прибор с электростатич. отражающим зеркалом, наз. масс-рефлектроном. Циклотронно-резонансный масс-анализатор -ячейка в виде прямоугольного параллелепипеда или куба, помещенная в однородное магн. поле. , попадая в ячейку, движутся в ней по спиральной траектории (циклотронное движение) с частотой w ц = 1 / 2 p z . H/m, где H - напряженность магн. поля, т. е. с одинаковыми значениями m/z имеют определенную циклотронную частоту. Действие прибора основано на резонансном поглощении энергии при совпадении частоты поля и циклотронной частоты . На применении циклотронно-резонансного масс-анализатора основан метод , к-рый используют для определения массы , в частности мол. , образующихся при ионно-молекулярных р-циях в газовой фазе; анализа структуры высокомол. ; определения кислотно-основных св-в в-в. Для легких R = 10 8 . Первый ионциклотронного резонанса построен Г. Соммером, Г. Томасом и Дж. Хиплом (США, 1950).
Детекторы (приемники) помещают на выходе прибора. Для детектирования используют электрометрич. усилители, позволяющие измерять ионные токи до 10 - 14 А, электронные умножители и сцинтилляц. детекторы с фотоумножителем, к-рые обеспечивают счет отдельных (ток 10 - 19 А) и имеют малую постоянную времени, а также , преимущество к-рых в возможности регистрации всех масс-спектра и накопление сигнала. Для введения в-ва в ионный источник существует спец. система, наз. системой напуска. Она обеспечивает ввод строго дозированных кол-в в-ва, его миним. термич. разложение, кратчайшую доставку к области ионизации и автоматич. смену образцов без нарушения . Система ввода и легколетучих в-в представляет собой холодные или обогреваемые стеклянные резервуары с вязкостными или мол. натекателями, через к-рое газообразное в-во поступает в область ионизации. При соединении с между ионным источником и помещается мол. сепаратор (струйный, пористый или мембранный), в к-ром удаляется газ-носитель и обогащается анализируемым в-вом. Система ввода труднолетучих в-в представляет собой чаще всего вакуумный шлюз, из к-рого ампула с в-вом вводится непосредственно в ионизац. камеру. Ампула укреплена на штоке, снабженном нагревателем, с помощью к-рого создается необходимая т-ра для в-ва. В нек-рых случаях ампула нагревается за счет тепла ионизац. камеры. Для уменьшения разложения в-ва повышают скорость нагревания , к-рая должна превышать скорость термич. разложения. Так действуют устройства, соединяющие жидкостной с ионным источником. Наиб. распространено устройство, основанное на термораспылении р-ра исследуемого в-ва, при к-ром происходит его ионизация. Др. тип - ленточный транспортер, на ленте к-рого в-во доставляется в ионный источник через систему шлюзов. При движении ленты происходит удаление р-рителя, а в ионном источнике при быстром нагревании ленты в-во испаряется и ионизируется. В нек-рых случаях возможны и ионизация в-ва в результате его бомбардировки ускоренными частицами на пов-сти ленты. Для труднолетучих неорг. соед. применяют спец. , наз. ячейкой Кнудсена. Это - высокотемпературная с тиглем, имеющим отверстие малого диаметра 0,1-0,3 мм, через к-рое протекает в условиях близких к равновесным. работает в условиях глубокого (10 - 5 - 10 - 6 Па и выше), к-рый позволяет свести к минимуму потерю разрешающей способности из-за столкновения ионного пучка с нейтральными . Ионный источник и масс-анализатор имеют разные системы откачки и соединяются между собой каналом такого размера, к-рый достаточен для прохождения ионного луча. Такая конструкция предохраняет падение в анализаторе при повышении в источнике . В источнике необходима также высокая скорость откачки для уменьшения эффекта памяти (удаление в-в, адсорбированных на внутр. пов-сти прибора). Обычно в приборах создают диффузионные . Применяют также турбомолекулярные , обеспечивающие получение сверхвысокого (10 - 7 - 10 - 8 Па) и откачку со скоростью неск. литров в секунду; эти не требуют применения охлаждаемых ловушек. Сбор данных и управление требует автоматизации всех процессов с помощью ЭВМ, к-рая позволяет проводить разл. типы исследований по заранее заданной программе с условий анализа в процессе работы прибора.
Применение масс-спектрометрии. Масс-спектрометрию широко применяют в разл. областях науки и техники: в и , физике, геологии, биологии, медицине, в пром-сти , в лакокрасочной и хим. пром-сти, в произ-ве и сверхчистых материалов, в ядерной технике, в с. х-ве и ветеринарии, в пищ. пром-сти, при анализе продуктов загрязнения и мн. др. Большие успехи достигнуты при анализе биологически важных в-в; показана возможность с мол. м. до 15000, с мол. м. до 45000 и т.д. Масс-спектрометрия нашла применение как экспрессный метод в медицине; принципы масс-спектрометрии лежат в основе устройства наиб. чувствит. течеискателей. Отечеств. , выпускаемые для разл. целей, имеют индексы: для исследования изотопного состава - МИ, для исследования хим. состава - MX, для - МС. Macс-спектрометрия в позволяет измерить точную мол. массу и рассчитать элементный состав исследуемого в-ва, установить хим. и пространств. строение, определить изотопный состав, провести качеств. и количеств. анализ сложных смесей орг. соединений. Одна из важнейших задач - нахождение зависимости между характером масс-спектра и строением исследуемой орг. . При ионизации орг. образуется мол. , в к-ром далее происходят процессы гетеро- и гомолитич. разрыва связей или разрыва связей с перегруппировкой и образование осколочных , к-рые в свою очередь могут подвергаться дальнейшему распаду. Последоват. распады , устанавливаемые из масс-спектра, наз. направлениями или путями распада. Направления распада - важная характеристика каждого класса соединений. Совокупность всех направлений распада составляет характерную для каждого орг. соед. схему фрагментации. Если масс-спектр прост, схема фрагментации сводится к одному пути распада, напр. при распаде мол. СН 3 ОН + последовательно образуются СН 2 =ОН + и Н-С=О + . В случае сложных масс-спектров схема фрагментации отвечает многим, часто перекрывающимся направлениям распада, напр. схема фрагментации :

Мол. распадается в результате разрыва связей СН-СО, СО-NH, NH-СН и СН-R с образованием осколочных соотв. А n и Х n , В n и Y n , С n и Z n , S n и R n (n - номер аминокислотного остатка в пептидной цепи), к-рые далее распадаются таким же образом. Общее кол-во пиков в таком спектре может достигать неск. сотен. Кол-во фрагментов определяется строением исследуемой , запасом внутр. энергии мол. и осколочных и промежутком времени между образованием и его детектированием. Поэтому при интерпретации масс-спектров необходимо учитывать как условия измерений (энергию ионизирующих , ускоряющее напряжение, в ионном источнике, т-ру ионизац. камеры), так и конструктивные особенности прибора. При макс. стандартизации условий измерений удается получать достаточно воспроизводимые масс-спектры. Сравнение масс-спектра исследуемой системы со спектром, имеющимся в каталоге, -наиб. быстрый и простой способ , в-в при определении загрязнения , контроле продуктов питания человека и животных, изучении процессов лек. препаратов, в криминалистике и т.д. Однако лишь на масс-спектра не может быть однозначной, напр. не все изомерные в-ва образуют различающиеся масс-спектры. В условиях масс-спектрометрии часть возбужденных распадается после выхода из ионного источника. Такие наз. метастабильными. В масс-спектрах они характеризуются уширенными пиками при нецелочисленных значениях т/z. Один из методов изучения таких - масс и кинетич. энергий . Изучение распада метастабильных проводят на приборах, у к-рых магн. анализатор предшествует электрическому. Магн. анализатор настраивают таким образом, чтобы он пропустил метастабильный