Гистологическая техника. Методы и техника микроскопирования

Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата.

¨ Задание:

1. Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.

Таблица 2

Методы и техника микроскопирования

1. Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой).

Различают:

Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами .

в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот методслужит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения.

г) Микроскопия в темном поле. Достигает объективатолько свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д.

д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.

е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

2. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдига – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц.

3. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

2. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним.

Работа с микроскопом . Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа.

С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив.

Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением.

Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость.

В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами.

Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения.

Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение.

Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований.

А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения.

3. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение.

Таблица 3

Препараты тканей с разным окрашиванием

Хотя бы один раз в год все люди проходят медицинские осмотры. Но мало кто знает, что происходит с их анализами в лаборатории, и какие диагностические мероприятия с ними проводят. А ведь от правильного лабораторного обследования зависит не только здоровье, но иногда даже жизнь. Поэтому методы микроскопического исследования играют немаловажную роль в выявлении и своевременном предупреждении различных вирусных и инфекционных заболеваний.

Микроскопия и ее разновидности

Микроскопия – исследование объектов посредством микроскопа. Предназначена для изучения микроорганизмов, а также иных объектов, которые непостижимы человеческому глазу. Имеет следующую классификацию:

• Стереоскопическая.

Используется для исследования объектов под разными углами, при этом изучая их двумя глазами. Увеличение небольшое – 120-ти кратное. Такой вид микроскопии используют в оперативном лечении маленьких структур организма, которые недосягаемы для человеческого глаза; в изучении мёртвых тканей; в судебной медицине.

• Инфракрасная.

Принцип действия – поглощение непрозрачных объектов, структурами света, длина волн которых достигает 700-1200 нанометров. Чтобы провести инфракрасную микроскопию не нужно производить специальную химическую обработку объекта. Данный метод применяется в зоологии, науках о биологической природе человека. Используется микроскопия в медицине : инфракрасную микроскопию используют в нейрохирургических целях, а также при изучении глаз, их анатомии и физиологии.

• Ультрафиолетовая.

Изучает свойства объекта посредством определения длины волн, которые поглощают ультрафиолетовое излучение, являясь способностью отдельного вещества, клетки, ткани данного объекта. Такой способностью обладают биополимеры, которые хранят генетический код; нуклеиновые кислоты; пропионовые кислоты; альфа-аминокислоты; калиевая соль; продукты азотистого обмена; лекарственные вещества; кристаллические вещества с температурой плавления больше 290 градусов. Благодаря ультрафиолетовой микроскопии определяют место концентрации искомых веществ, а, если объект живой, то можно исследовать его структурные изменения в процессе жизнедеятельности.

• Люминесцентная.

Основной принцип работы – изучение объектов посредством их свойств свечения в ультрафиолетовых лучах или сине-фиолетовой части спектра. Большинство биологических веществ, например, белки, молекулы небелковой природы, низкомолекулярные органические соединения и лекарственные препараты имеют «врожденную» люминесценцию. Иные вещества светятся лишь после добавления конкретных красителей – синтетических соединений природного характера, которые начинают светиться при контакте с ультрафиолетовыми и синими лучами. Такой краситель может попадать в клетку при малейшем контакте, а может распределяться по клеткам избирательно, окрашивая при этом отдельные биосоединения изучаемого объекта. В мероприятиях, посвященных гистохимическим исследованиям, метод люминесцентной микроскопии – это единственный способ обнаружить вирусную концентрацию в клетках, изучить структуру распада продуктов обмена веществ, определить антигены и антитела. Лечение таких болезней, как герпес, гнойное поражение железистых органов, воспаление тканей печени, грипп – не обходится без люминесцентной микроскопии. Также, с ее помощью можно распознать злокачественную опухоль, предупредить сердечно-сосудистые заболевания, исследовать микрофлору слизистой оболочки носа и диагностировать вирусные недуги.

• Интерференционная.

Имеет общую структуру анализа с фазово-контрастной микроскопией, но в отличие от последней, где можно изучать лишь контуры исследуемого объекта, здесь появилась возможность делать микроскопическую экспертизу прозрачных объектов, а также брать количественный анализ. Такой результат появляется вследствие преломления луча света на два пучка: первый проходит через структурные компоненты изучаемого объекта, а второй минует их. В объективе микроскопа кажется, что оба пучка соединяются и налагаются друг на друга. Разница фаз, которая возникает, можно измерить посредством определения массы разнообразных клеточных структур. Если измерять данную разницу последовательно, используя показатели преломления, то можно узнать плотность, ширину и толщину изучаемых объектов и их тканей, содержится ли в них вода или иные компоненты, имеется ли в них белок. Химические и физические свойства мембран, активность ферментов, обмен веществ на клеточном уровне – это лишь малая часть того, что можно узнать благодаря интерференционной микроскопии.

• Фазово-контрастная.
• Рентгеновская.

Применяется для исследования особо малых объектов, которые по своим размерам не больше рентгеновской волны (0,01-1 нм). Подразделяется на следующие подвиды: проекционная, работающая посредством источника излучения и регистрирующего устройства; отражательная – использует специальные монокристаллы, система зеркал, рассеянное на кристалле рентгеновское излучение.

Своё применение рентгеновская микроскопия нашла в изучении генезиса минералов, медицине, а также науке, изучающей химический состав и структуру металлов. Отличительной особенностью данного метода является возможность изучать непрепарированные живые клетки.

Этот рентгеноструктурный анализ может быть лазерным – когда изучаются одиночные молекулы и их связи.

• Поляризационная.

Лучи, которые появляются посредством поляризации двух взаимоперпендикулярных полостей, образуют свет, в котором исследуют различные объекты – это и есть принцип действия поляризационной микроскопии. Между источником излучения и объектом помещают специальные призмы с эффектом двойного лучепреломления, которые отражают электромагнитные и звуковые волны. В сочетании со специальным светофильтром, такая конструкция позволяет изучать анизотропные структуры клеток, микроскопические компоненты тканей, молекулярную организацию структуры объекта. Поляризационная микроскопия используется для исследования клеток и тканей растительных и животных организмов. Также применяется при идентификации возбудителя различных иммунных заболеваний; при изучении жизни клеток, их жизненно важных компонентов, их функций и процесса размножения. Основное назначение данного метода исследования – изучение животных и растительных тканей, минералов, анизотропных микрообъектов.

• Электронная.

Применяется в случае, если объект находится вне пределов видимости оптического микроскопа. Обычно, размер исследуемых образцов, которые изучаются данным методом – 1 микрон и менее. Принцип действия заключается в использовании потока отрицательно заряженных частиц, которые играют роль светового луча. Линзы в таком микроскопе – магнитные. Отдельные участки исследуемых объектов по-разному задерживают отрицательно заряженные частицы, поэтому изображение получается чёрно-белым, где сам объект увеличен в тысячи раз. Сегодня электронная микроскопия используется для изучения строения, функции и развития клетки. Также применяется в сферах исследования морфологии и структуры микроорганизмов, их жизнедеятельности и генетики. Немаловажный вклад данный метод внес в развитие такой науки как вирусология. Если бы не электронная микроскопия, законы жизнедеятельности клеток были бы до сих пор не изучены, а значит многие онкологические заболевания были бы неизлечимы.

Для того, чтобы провести электронную микроскопию, объекты, которые являются изучаемым материалом, подвергаются физической и химической фиксации, после чего их обезвоживают и разделяют на ультратонкие срезы, чтобы было легче их контрастировать и исследовать.

Электронная микроскопия позволяет увеличивать изображение объекта на много сотен тысяч раз. Минусом данного метода я является то, что он предназначен для изучения неактивных, обезвоженных, мёртвых объектов. Научный вклад в медицину этой методики микроскопии – очень велик, но применять ее в диагностических и практических целях – пока невозможно. Световая и электронная микроскопия имеет общий признак – увеличение изображения с последующим описанием форм объекта и сравнением этих форм с функциональными, а также химическими свойствами

• Иммуноэлектронная микроскопия.

Применяется для исследования взаимодействия антигена и антител. Принцип действия: материал, который исследуется смешивают с иммунной сывороткой, инкубируют его; жидкость и твердые частицы разделяются на фракции по плотности; затем происходит осаждение антител и разделенных частиц на объект; после этого, к смешанному клеточному осадку добавляют вещество, усиливающее контрастность; и только после всего этого, полученный препарат исследуют под микроскопом.

Применяется для диагностики вирусного гепатита, а также для выявления антигенов, которые будут бороться с различными вирусными заболеваниями.

• Световая.

Обеспечивает цветное изображение, увеличенное в две-три тысячи раз. Также, при световой микроскопии возможно продолжительное наблюдение за подвижным объектом, и что немаловажно – микрокиносъёмка. Используется для оценки хода развития объекта, его состояния движения, а также для исследования его изменений под воздействием окружающих его факторов. Кроме разрешающей способности микроскопа, важную роль играет амплитуда светового луча и типология исследуемого объекта, так как свойства последнего имеют огромное влияние на оптическое излучение: цвет, контрастность, резкость, световая фаза, плоскость, по которой распространяется волна. Именно благодаря этим факторам и строится методология микроскопических исследований, например, в данном виде микроскопии, объект окрашивают, чтобы определить его свойства, потому что краска помогает изучить конкретные свойства убитых клеток. Но это не значит, что световая микроскопия занимается изучением лишь мертвых биологических объектов. Благодаря темнопольной микроскопии (подвид оптической), где свойства и чёткость изображения зависит ли излучения, которое рассеивается исследуемым образцом, освещающий световой пучок не попадает в глазок, и картинку изучаемого образца учёные видят в рассеянном свете. Используется для изучения водных одноклеточных организмов, а также живых объектов, которые могут быть как окрашенными, так и наоборот.`]]

Световая микроскопия. В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы. И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Виды световой микроскопии:

1) Иммерсионная световая микроскопия. Иммерсионные объективы используются для изучения объектов невидимых или плохо видимых через сухие системы микроскопа.2) Фазовоконтрастная микроскопия предназначена для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля.3) Аноптральная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.4) Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом).5) Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов).6) Темнопольная микроскопия. При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).7) Люминесцентная микроскопия - метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучамиЛюминесцентная микроскопия. Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждаемого люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуохромами (акридиновый оранжевый, изотиоционат флуоресцеина и др.). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи. В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне видны будут клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом. Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуохромами, не причиняющими вреда миробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Темнопольная микроскопия. При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В обектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы. Так как аппаратура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.

Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.

Фазово-контрастная микроскопия. Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.

Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.

Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т.д.).

Электронная микроскопия. Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию. Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света).

Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной). При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания.

Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Виды электронных микроскопов:

1) Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) - это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране. Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска.

2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) - прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров). Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв;

3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ. STM - scanning tunneling microscope) - прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем. При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å.

Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой.

Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме. Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение. В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами. Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую.

Недостатки электронного микроскопа:

1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;

2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;

3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;

4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;

Микроскопия - это исследование объектов с помощью особых увеличительных приборов - микроскопов.

Для получения увеличенных изображений в микроскопах используют проходящее или отраженное от объекта квантовое излучение различного вида (видимого диапазона, ультрафиолетовое или рентгеновское), а также потоки элементарных частиц (поток электронов). Поэтому существует несколько разновидностей микроскопического метода: световая, ультрафиолетовая, рентгеновская, электронная микроскопии. Наиболее распространены в цитологии и гистологии световая и электронная микроскопии.

Методы микроскопирования позволяют наблюдать и изучать только такие объекты или их структуры, размеры которых превосходят половину длины волны излучения, используемого в конкретном методе. Таким образом, основной характеристикой любого микроскопа является значение его предельного разрешаемого расстояния d (разрешающая способность, или разрешение).

Разрешение - это наименьшее расстояние между двумя точками объекта, при котором они видны раздельно; наименьший размер объекта, при котором микроскоп еще «разрешает» рассмотреть детали изображения.

Теоретически предельная разрешающая способность выражается формулой, из которой следует, что чем короче длина волны излучения, используемого в микроскопе, тем выше его разрешение и, следовательно, больше максимальное увеличение. Разрешение светового микроскопа равно 0,25 мкм, так как средняя длина волны кванта света видимого диапазона равна 0,5 мкм, что позволяет увеличивать изображение в 1500 раз.

В электронном микроскопе длина волны потока электронов равняется 0,000005 мкм, поэтому он позволяет рассматривать объекты, размеры которых в 100 000 раз меньше, и практически достигать увеличений в 1 000 000 раз.

Объект в микроскопах может освещаться двумя основными способами: излучение проходит через него или отражается. В первом случае исследуют внутреннюю структуру, во втором - поверхность объекта.

Микроскопы, в которых используют разные способы освещения, значительно различаются по конструкции и имеют разные названия: просвечивающие (трансмиссионные) - микроскопы проходящего света; микроскопы отраженного света - сканирующие (растровые).

Наиболее часто в клинической и экспериментальной практике применяют световой микроскоп, позволяющий изучать гистологические препараты в проходящем свете и светлом поле.

При световой микроскопии для достижения специальных цепей применяют и другие методы изучения и наблюдения гистологического препарата. Эти методы реализуют с помощью дополнительных приставок и устройств к обычным биологическим микроскопам или с помощью специализированных микроскопов.

Широко используют метод темного поля, когда объект освещается только косым светом с боковых сторон, поэтому детали объекта контурно выделяются на темном фоне.

Метод фазового контраста предполагает, что объект освещают два луча со сдвинутой на четверть длиной волны фазы. Проходя через объект с разных сторон и дополнительно сдвигаясь по фазе структурами препарата, эти лучи в области первичного изображения скрещиваются. Вследствие интерференции происходит сложение или вычитание их амплитуд, что выражается в сильном изменении яркости структур объекта и сильном повышении его зрительного контраста.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на флюоресценции - вынужденном свечении некоторых веществ, входящих в состав клеточных и тканевых структур, при освещении их лучами света с короткой длиной волны (первичная флюоресценция) или на флюоресценции специальных люминесцентных красителей (флюорохромов), которыми окрашивают препарат (вторичная люминесценция). При этом возбуждающий люминесценцию свет задерживается специальным (запирающим) фильтром окуляра и флюоресценция становится видна в поле зрения микроскопа. Этот метод позволяет выявлять не только невидимые с помощью других методов структуры клеток и тканей, но и судить об их качественном химическом составе.

Поляризационная микроскопия основана на способности некоторых веществ клеток и тканей вращать плоскость поляризации световых лучей. Объект освещают поляризованным светом, прошедшим через поляризационный фильтр. Перед окуляром ставят второй поляризационный фильтр (анализатор), располагая его плоскость поляризации перпендикулярно первому фильтру (поляризатору). Свет не пройдет в окуляр, но если в плоскости поля зрения находятся структуры, например коллагеновые волокна, способные вращать плоскость поляризации световых лучей (обладающие анизотропией), их изображение можно наблюдать. По особенностям изображения поляризационная микроскопия напоминает темнопольную.

Изображение регистрируют фото — и видеокамерами, в том числе и цифровыми, позволяющими вводить изображение в компьютер и обрабатывать его электронными методами с последующим выводом на экран монитора или распечатывать.

При электронной микроскопии источник света заменен источником электронов (электронная пушка), с помощью высокого напряжения (100 000 В) разогнанных до большой скорости. Электроны, прошедшие через изготовленный по особым методикам препарат, находящийся в вакууме, фокусируются не стеклянными, а электромагнитными линзами, играющими роль объектива и окуляра, и проецируются на экран, покрытый люминофором. Подобно экрану телевизора под действием электронов он светится в видимом диапазоне, позволяя видеть увеличенные в сотни тысяч раз структуры объекта. Если узкий электронный луч не проходит через препарат, а последовательно пробегает (сканирует) его поверхность, в результате чего образуется трехмерное изображение, то данная разновидность электронного микроскопа называется растровой (сканирующей).

В большинстве случаев, чтобы сделать объект пригодным для морфологического исследования с помощью микроскопа, ткани и органы подвергают сложной предварительной подготовке, в результате которой получают цитологический препарат.

Цитологический препарат может быть временным, если он служит для одномоментного исследования и не предназначен для длительного хранения, и постоянным, который делают с расчетом на многократное повторное изучение и сохраняют неопределенное время.

Для качественных исследований в цитологии используют различные цито — и гистохимические методы, которые позволяют установить локализацию определенных веществ или биохимических процессов в тканевых и клеточных структурах.

Цитохимические реакции чаще всего проводят на криостатных (приготовленных с помощью замораживающего микротома) срезах. О локализации исследуемого вещества судят по отложению окрашенного продукта реакции. Например, для выявления в клетках ДНК и РНК применяют реактив Фельгена, который дает с нуклеиновыми кислотами розово-фиолетовую окраску. Гликоген выявляют с помощью ШИК-реакции (реактив Шиффа и йодная кислота), продукты которой имеют ярко-малиновую окраску.

Разновидностью гистохимического исследования является иммуногистохимическая методика, принцип которой основан на специфическом взаимодействии меченых антител (АТ) с тканевыми антигенами (АГ). Для мечения антител применяют люминесцентные красители (флюорохромы), а также ферменты (пероксидазу хрена) или электронно-плотные частицы для электронной иммуногистохимии (коллоидное золото). При прямом методе меченые антитела непосредственно взаимодействуют с антигенами, при непрямом методе немеченые (первые) антитела специфически и взаимодействуют с антигенами ткани, меченые (вторые) взаимодействуют с немечеными (первыми) антителами, которые для вторых антител являются антигеном, что значительно повышает чувствительность метода.

Из других качественных методов следует упомянуть об авторадиографии, которая позволяет изучать процессы метаболизма в т метках и тканях с помощью радиоактивной метки, включенной в состав биологического субстрата, используемого клеткой. Место локализации метки можно обнаружить по почернению фотоэмульсии, которой покрывают препарат.

Гибридизацией in situ изучают локализацию генов и их экспрессию. С помощью короткого отрезка меченой нуклеиновой кислоты можно найти и пометить соответствующую ей последовательность нуклеиновых кислот в клетке. Локализацию метки, по которой судят о локализации или экспрессии исследуемого гена, обычно выявляют радиоавтографическим методом. С помощью гибридизации можно специфически выявить очень малые концентрации синтезируемых клеткой веществ.

Количественные методы в гистологии необходимы для получения объективных данных об изменениях клеточных структур в норме, в эксперименте или при патологии. Основные количественные показатели структурных компонентов клеток и тканей - это морфометрические (число структур и их геометрические размеры) и денситометрические (отражающие концентрацию, оптическую плотность химических веществ в этих структурах) параметры. Для их выявления применяют морфометрические и спектрофотометрические методы.

Морфометрический метод включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследуемых объектов. Число структур, их площади, диаметры, периметры и другие показатели измеряют с помощью специальных морфометрических сеток, курвиметра и метода вычисления весовых соотношений путем взвешивания. Микроструктуры в световых микроскопах измеряют с помощью окуляр-микрометра или вставляемых в окуляр морфометрических сеток. Также морфометрию проводят по изображениям исследуемых объектов на фотографиях. Морфометрический анализ в последние годы усовершенствовали за счет внедрения компьютерных методов. С помощью цитоспектрофотометрии определяют химический состав, концентрацию и количество различных веществ, содержащихся в конкретных структурах клеток и тканей с помощью специальных приборов цитоспектрофотометров. Они регистрируют спектры поглощения или излучения участков цитологического препарата и по их интенсивности судят о количественном содержании исследуемых веществ.

Важность науки в жизни всего общества отрицать очень сложно. Учёные и их разработки дали обществу всё то, чем оно теперь пользуется с радостью и наслаждается. Разработки учёных в разных областях позволяют побеждать смертельные болезни, бороться с психическими расстройствами, создавать уникальную «умную» технику и даже роботов. Возможности науки поистине безграничны. Новые лица всегда приносят с собой новые идеи, которые становятся основой для будущих разработок. Однако множество разработок базируется на простых и проверенных методах.

Многие мудрецы прошлого говорили о том, что существует макро-, микромир. На том этапе развития люди не могли осознать всю глубину этих слов. Ведь макро- и микромир действительно существуют и очень тесно взаимодействуют. Крохотные изменения в структуре клетки могут быть вызваны глобальными изменениями в Солнечной системе. На сегодняшний день доказать или опровергнуть такую взаимосвязь очень сложно, но исследования мира бактерий и клеток говорят о том, что клетка - это маленькая Вселенная.

Микроскопия

Микроскопия - это научное при помощи микроскопа. В переводе с греческого это слово означает «маленький, небольшой». Микроскопия может подразделяться на несколько подвидов: оптическую, многофотонную, рентгеновскую, лазерную и электронную. Цель этого способа исследования заключается в увеличенном наблюдении за объектом и регистрацией замеченных изменений.

История микроскопа

В начале своего исторического развития микроскопы представляли собой которые использовали лучи видимого света. Такие приборы были очень слабы для наблюдения и подходили только для простейших операций. Идея возникновения электронного микроскопа возникла в тот момент, когда учёные задумались о замене электромагнитного излучения на электронный пучок. Это событие стало для развития электронного микроскопа, который значительно расширил возможности наблюдения за объектом.

Методы микроскопии

Для того чтобы правильно и тщательно обследовать какой-либо объект, необходимо работать по определённому алгоритму. Подобные алгоритмы вырабатываются один раз и применяются годами. Для того чтобы изучать окружающий мир при помощи специальной техники, необходимо владеть особыми методами. Методы микроскопии - это совокупность различных алгоритмов, следуя которым, можно основательно и системно изучить конкретный объект микромира. Прохождение пучка света через микроскоп сопровождается некоторыми изменениями первоначальных характеристик, которые могут быть вызваны структурным строением предмета. Этот процесс может сопровождаться рядов оптических эффектов, таких как отражение, поглощение, преломление, дисперсия и т.д.

Методы световой микроскопии

Световая микроскопия - это система методов, которые используют различные оптические эффекты для достоверного отображения результатов. Видимые элементы и характер полученного изображения будут во многом зависеть от освещения. Всего насчитывается большое количество методов микроскопии: светлого поля, косого освещения, интерференционного контраста, тёмного поля, поляризационный метод, фазово-контрастная, ультрафиолетовая, люминесцентная, инфракрасная микроскопия, конфокальный микроскоп.

Все эти методы имеют определённые достоинства и недостатки. При работе с образцом выбирать тот или иной метод следует исходя из его адекватности в данной ситуации. Сильные и слабые стороны каждого метода не важны в целом, главное, чтобы метод был применим в заданных условиях.

Микроскопия и медицина

Применение микроскопии в медицине имеет огромный потенциал. На сегодняшний день благодаря микроскопам можно исследовать различные клетки организма человека для того, чтобы точно определять состояние здоровья. Клетки организма дают наиболее точный и достоверный результат, который до недавнего времени было невозможно получить, так как микроскопы не могли дать исчерпывающей информации.

Использование таких приборов очень перспективно, ведь методы лечения и диагностики могут разительно преобразиться и вовсе перейти на новый уровень. Исследование с помощью микроскопов известно и применяется длительное время, однако наука стоит на пороге того, чтобы лечить человека клетками. Это уникальная возможность, которая позволит отойти от привычных методов лечения и забыть о лекарствах. Клетка - самый мощный элемент организма. Говорить о том, какую пользу может принести пересадка больному человеку здоровых клеток, просто бессмысленно, ведь это очевидно.

Исследование мочи

Общий анализ мочи - это комплекс мероприятий, которые направлены на исследование свойств мочи и её физико-химического состава. Важными показателями при этом являются цвет, запах, реакция, прозрачность, плотность, а также содержание в моче различных веществ. Микроскопия осадка мочи позволяет определить наличие солей, клеточных элементов и цилиндров. Следует понимать, что моча - это конечный продукт деятельности почек, который может очень точно отображать состояние обменных процессов и крови в организме.

Анализ осадка мочи

Микроскопия мочи позволяет создать более полную картину при полном обследовании организма. Также мазок часто используют для обычной и дифференциальной диагностики болезней мочевыводящих путей и почек. Во время лечения микроскопию мочи могут назначать для того, чтобы получить оценку эффективности докторского вмешательства. Исследование мочи позволяет выявить конкретные или потенциальные проблемы в водно-электролитном балансе организма, также в процессе обмена веществ. Анализ мочи весьма эффективен при диагностике на болезни желудочно-кишечного тракта, а также при инфекционных и воспалительных процессах в организме. Иногда микроскопию мочи используются для того, чтобы следить за состоянием пациента в период терапевтического или хирургического лечения.

Исследование крови под микроскопом

Кровяные тельца формируются в красном костном мозге, а затем выбрасываются в кровоток. Каждая выполняет свою определённую функцию. Лейкоциты нужны для борьбы с инфекционными клетками, эритроциты способствуют обогащению клеток кислородов и удалению из них углекислого газа, тромбоциты очень важны для гемостаза. В нормальных условиях тело человека вырабатывает нормативное значение всех клеток, которое не выходит за определённые рамки. При возникновении каких-либо осложнений или при болезни клетки крови могут менять свои размеры, форму, цвет и количество. Только благодаря точному микроскопическому исследованию можно определить состояние клеток и сделать соответствующие выводы.

Кровь - это живительная жидкость организма, которая обеспечивает обмен полезными веществами между всеми клетками. Микроскопия мазка крови - это исследование, которое производится под микроскопом. Исследуется препарат, приготовленный из одной капли крови. Эта процедура входит в общий анализ крови или лейкоцитарную формулу и отдельно не совершается.

Микроскопия мазка

Для чего нужен Микроскопия мазка крови даёт специалисту очень важные знания о состоянии здоровья человека. При помощи этого анализа можно определить количественное соотношение эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, а также их формы и размер. Кроме того, позволяет определять количественное выражение незрелых лейкоцитов, что является очень важным моментом в ряде заболеваний. Также мазок крови позволяет качественно диагностировать заболевания, которые могут быть связаны с нарушениями функций крови, её образования, свёртываемостью, а также разрушением Очень важной задачей микроскопического мазка на кровь является регулярное отслеживание состояния клеток крови, их зрелость после лучевой и химиотерапии, при проблемах с гемоглобином, а также при лейкозах.

Назначается мазок на кровь в том случае, если общий анализ крови показал, что увеличено количественное выражение лейкоцитов, незрелых или атипичных клеток. Для мазка можно использовать биоматериал из крови или капилляров.

Биология и микроскопы

Биология значительно расширяет возможности использования микроскопов. Как уже говорилось раньше, цитология во многом опирается на современные и мощные микроскопы. Микроскопия в биологии открывает для учёных невиданные просторы для опытов и исследований. Современные разработки позволяют уже сейчас говорить о том, какое будущее нас ждёт.

Микроскопия в биологии имеет очень широкое применение. Приборы позволяют исследовать организмы, которые недоступны глазу человека, но очень важны для научных экспериментов. В биологии чаще всего используют метод электронной микроскопии, который даёт изображение за счёт направленного потока электронов. При этом даже световой микроскоп позволяет исследовать живые биологические объекты.

Метод микроскопии в биологии применяется очень активно, так как практически все разновидности применимы для биологических исследований. Интерференционная микроскопия позволяет исследовать прозрачные жидкости и объекты, а также давать их качественный анализ. Это возможно благодаря тому, что луч света, проходя через прибор, раздваивается: одна его часть проходит через объект, а другая - мимо. Таким образом, два луча интерферируют и соединяются, давая полноценное изображение.

Микроскопия в разных областях применения

Область применения микроскопии очень широка. Несмотря на то что изначально микроскопы были предназначены для исследований в области биологии, на сегодняшний день сфера их влияния значительно расширилась. Микроскопия - это комплекс методов, который нашёл своё применение при анализе твёрдых и кристаллических тел, структуре и строений поверхностей. Также микроскопы активно используются в медицине не только для диагностики, но и при выполнении микрохирургических операций. Более того, известно, что учёными был разработан подводный лазерный микроскоп, цель которого состоит в поиске внеземной жизни на Европе.

Также не следует забывать о бурном развитии нанотехнологий, которые немыслимы без микроскопов. Развитие этой отрасли приводит к тому, что разновидности микроприборов постоянно совершенствуются. Более того, появляются новые которые предназначены для исследования определённой среды.

Подводя некоторые итоги, следует сказать о том, что микроскопия - это перспективная область, которая с каждым годом развивается всё более активно. Интерес к стволовым клеткам человека, а также развитие нанотехнологий ведёт к тому, что микроскопы становятся неотъемлемой частью любой исследовательской работы.